Надо Знать

добавить знаний



Зеленый флуоресцентный белок



План:


Введение

Ленточная диаграмма GFP. Данные PDB 1EMA.
Мышь, в клетках которой экспрессируется GFP

Зеленый флуоресцентный белок ( англ. Green Fluorescent Protein , GFP) - белок массой 26,9 кДа, состоящий из 238 аминокислотных остатков, впервые выделенный из медузы Aequorea victoria / Aequorea aequorea / Aequorea forskalea, что флюоресцуе зеленым светом при возбуждении светом синего цвета [1] [2]. GFP с A. victoria имеет главный пик возбуждения с длиной волны 395 нм и меньше пик - с длиной волны 475 Нм. Пик его спектра излучения приходится на 509 нм, в зеленой части видимого спектра. GFP от морского карандаша (Renilla reniformis) имеет один пик возбуждения при 498 нм. Сейчас GFP широко используется в клеточной и молекулярной биологии в качестве репортера экспрессии генов и внутриклеточной локализации белков [3]. Со времени открытия на основе GFP методами генной инженерии были разработаны многочисленные новые варианты, которые имеют значительно больший квантовый выход флюоресценции и имеют разные цветовые (синий, сине-зеленый, желтый, красный и другие флюоресцентные белки) или моеуть менять цвет со временем или в зависимости от условий внутриклеточного среды. Ген GFP или причудливый белок GFP с любым другим белком может быть введен в генома организма и реплицироваться вместе с ним, или (для экспрессии в небольшой части многоклеточного организма) может быть введен местной инъекцией в составе вирусного вектора. Сейчас модифицировать десятки тысяч генов многих видов бактерий, дрожжей, других грибов, растений, насекомых и нескольких видов млекопитающих, используя GFP как маркер.


1. История

Зеленый флуоресцентный белок был выделен вместе с другим белком екворином, также светился, из медузы Aequorea victoria Осаму Симомура, который в 1960 году приехал с Японии к Принстонского университета и начал изучать биолюминесценцию медуз. В 1960-1970-е годы он выделил оба белка и начал исследования механизма их свечение. Оказалось, что в A. victoria взаимодействие ионов кальция с екворином вызывает голубое свечение белка. Часть этой биолюминесценции переносится на зеленый флюоресцентный белок с помощью флюоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), этот белок поглощает синий свет и излучает свет зеленого цвета, что в целом приводит к зеленому смещения в свечении медузы.

Применение GFP в молекулярной биологии началось в 1990-х годах. В 1992 году Дуглас Прешер склонував и секвенував ген белка, после чего из-за недостатка финансирования вынужден закрыть проект и разослал полученную ДНК до нескольких лабораторий, в том числе в лаборатории Мартина Чалфи. В группе Мартина Чалфи была осуществлена экспрессия белка в бактерии Escherichia coli и черви Caenorhabditis elegans, результаты этой работы были опубликовано в журнале Science в 1994 году. Месяц спустя были опубликованы независимые результаты из лаборатории Фредерика Цуи. Оказалось, что GFP принимал нативную конформацию и образовывал флюорофор при комнатной температуре и без добавления дополнительных кофакторов, что обеспечило возможность использования белка в качестве маркера в клетках многих организмов.

Кристаллическая структура белка была расшифрована в 1996 году в лаборатории Ремингтон. Она прояснила механизм образования флюорофору и роль окружающих аминокислот. Это позволило получать мутанты GFP с повышенной устойчивостью, с разными спектрами флуоресценции и другими улучшенными свойствами по сравнению с белком дикого типа.

В 2008 Мартин Чалфи, Осаму Симомура и Роджер Цянь получили Нобелевскую премию по химии за открытие и разработку зеленого флюоресцентного белка (GFP).


2. Структура

Ленточная репрезентация полного белка GFP и GFP с удаленной частью бета-барреля, показывающие флюорофор (изображен в представлении слоев и палочек) PDB 1GFL.

GFP имеет классическую структуру бета-барреля, состоящий из одного β-листа и альфа-спирали с флюорофором в центре [4] [5]. Плотно упакованный бета-лист защищает флюорофор от тушения окружающей средой, а направлены внутрь боковые цепи бета-барреля катализируют образование трипептидного комплекса Ser 65 - Tyr 66 - Gly 67 (обозначение положений для GFP дикого типа), образующие флюорофор. Процесс свертывания проходит через серию последовательных шагов, в течение которых изменяются оптические свойства белка, весь процесс в случае GFP дикого типа занимает около 30-40 минут и называется "созреванием" белка. Некоторые модифицированные версии белка могут иметь как значительно короче (например, Venus), так и значительно дольше созревания.


3. Производные GFP

Многообразие генетических мутаций на примере этого изображения, нарисованного живыми бактериями, экспрессирующих 8 типов флюоресцентных белков разного цвета.

Через значительный потенциал для многих применений были разработаны многочисленные варианты GFP [6]. Первое значительное улучшение было осуществлено с помощью одной точечной мутации ( S 65 T), сообщенной в 1995 году в журнале Nature Роджером Цянем [7]. Эта мутация значительно улучшила спектральные характеристики GFP, в частности привела к увеличению квантового выхода флюоресценции, фотостабильности и увеличение стоксова сдвига, таким образом, что максимум поглощения оказался на 488 нм, тогда как максимум излучения остался на 509 нм. Такое положение максимумов привело к хорошему свивпадання спектров GFP и флюоресцеином (FITC), что позволило использования тех же фильтров, увеличивая привлекательность для многих исследователей. Добавление еще одной точечной мутации ( F 64 L) привело к возможности эффективного сворачивания белка при температуре 37 ? C, этот вариант белка получил название EGFP ( англ. enhanced . EGFP имеет коэффициент поглощения (или оптический поперечное сечение, сказывается ε) 9,13 ? 10 -21 м ? / молекулу или 55000 M -1 см -1 [8], его квантовый выход (QY) составляет 0,60. Относительная яркость (ε ? QY), таким образом, составляет 33000 M -1 см -1.

В 2006 году появилось сообщение о "суперзгортаючийся GFP" (superfolder GFP), модифицированный во многих местах вариант GFP, что сворачивается заметно скорее GFP дикого типа, даже в случаях, когда этот белок связан с другим белком, сворачивается очень медленно [9].

Многие другие мутаций включают разноцветные версии этого белка, среди них популярные производные голубого флюоресцентного белка (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), цианового флюоресцентного белка (ECFP, Cerulean, CyPet) и желтого флюоресцентного белка (YFP, Citrine, Venus, YPet). Производные BFP (кроме mKalama1) содержат мутацию Y 66 H. Критической мутацией для создания CFP есть Y 66 W, что вызывает образование хромофора с индольных структурой вместо фенольной. Добавление этой мутации требует нескольких дополнительных мутаций в бета-барреля, позволяющая восстановить яркость белка, уменьшенную через стерические ограничения, вызванные большим размером индольонои группы по сравнению с фенольной. Красное смещение YFP ​​и его производных осуществляется посредством мутации T 203 Y и вызывается взаимодействием стекингу π-электронных орбиталей упомянутого остатка тирозина и хромофора [2]. Два последних класса спектральных вариантов (производные CFP и YFP) часто используются для флюоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Генетически закодированные репортеры FRET чувствительны к некоторым сигнальных молекул, таких как кальций и глутамат, состояния фосфорилирования некоторых белков, димеризации белков и других процессов клеточной активности.

Полурациональные мутагенез многих остатков привел к созданию вариантов GFP, чувствительных к кислотности среды, так называемых pH-люоринив (pHluorins). Так, используя быструю смену кислотности при эндоцитозе синаптических везикул, pH-люорины, связанные с синаптобревином, успешно использовались для визуализации синаптической активности нейронов [10].

Номенклатура модифицированных вариантов GFP часто противоречивая и непонятная через использование одного названия для клиькои связанных вариантов. Так, mGFP может обозначать GFP с N-терминальным пальмитолюванням, что заставляет GFP связываться с клеточными мембранами. однако, это название также используется для обозначения мономерного GFP, созданного мутации A 206 K на поверхности взаимодействия димеров (GFP дикого типа имеет некоторую тенденцию к димеризации при концентрациях более 5 мг / мл). mGFP также может обозначать "модифицированный GFP", оптимизированный заменой нескольких аминокислот для стабильной экспрессии в клетках растений.


См.. также

Биолюминесценция


код для вставки
Данный текст может содержать ошибки.

скачать

© Надо Знать
написать нам